Апоптоз

Смерть клеток в организме может происходит 2 путями: некроза и апоптоза .

Апоптоз – это такой тип гибели клеток, при котором сама клетка активно участвует в процессе своей гибели, т.е. происходит самоуничтожение клетки. Апоптоз, в отличие от некроза, является процессом активным, после воздействия этиологических факторов запускается генетически запрограммированный каскад реакций, сопровождающийся активацией определенных генов, синтезом белков, ферментов, приводящих к эффективному и быстрому удалению клетки из ткани.

Причины апоптоза.

1. Во время эмбриогенеза апоптоз играет важную роль в разрушении различных тканевых зачатков и формировании органов.

2. Апоптозу подвергаются стареющие клетки, закончившие цикл своего развития, например, исчерпавшие запас цитокинов лимфоциты.

3. В растущих тканях определенная часть дочерних клеток подвергается апоптозу. Процент погибающих клеток может регулироваться системными и местными гормонами.

4. Причиной апоптоза может быть слабое воздействие повреждающих факторов, которые при большей интенсивности могут привести к некрозу (гипоксия, ионизирующее излучение, токсины и др.)

Патогенез апоптоза:

Клетка подвергается апоптозу, если в ядре происходит повреждение ДНК, которое не может быть исправлено системой репарации. За данным процессом следит белок, кодируемый геном р53. При невозможности устранения дефекта ДНК под действием р53-протеина активируется программа апоптоза.

На многих клетках имеются рецепторы, воздействие на которые вызывает активацию апоптоза. Наиболее изученными являются Fas-рецептор, обнаруженный на лимфоцитах, и рецептор к фактору некроза опухолей-альфа (TNF-α), обнаруженный на многих клетках. Данные рецепторы играют большую роль в удалении аутореактивных лимфоцитов и регуляции постоянства размера клеточной популяции по типу обратной связи.

Активировать апоптоз могут различные метаболиты и гормоны: противовоспалительные цитокины, стероидные гормоны, окись азота (NO) и свободные радикалы.

Апоптоз клеток активируется при недостатке кислорода в тканях. Причиной его активации может быть действие свободных радикалов, нарушение энергетически зависимых процессов репарации ДНК и др.

Апоптозу подвергаются клетки, утратившие связь с межклеточным матриксом, базальной мембраной или соседними клетками. Утрата данного механизма апоптоза в опухолевых клетках приводит к появлению способности метастазировать.

Некоторые вирусные белки могут активировать апоптоз клеток после самосборки вируса в зараженной клетке. Поглощение апоптотических телец соседними клетками ведет к их заражению вирусом. Вирус СПИДа также может активировать апоптоз незараженных клеток, имеющих на своей поверхности CD4-рецептор.

Также существуют факторы, препятствующие апоптозу. Замедлять апоптоз могут многие метаболиты и гормоны, например, половые гормоны, провоспалительные цитокины. Апоптоз может резко замедляться при дефектах в механизме гибели клетки, например, при мутации в гене р53 или активации генов, тормозящих апоптоз (bcl-2). Многие вирусы обладают способностью ингибировать апоптоз после встраивания собственной ДНК в геном клетки на период синтеза собственных структурных белков.

Морфологические проявления апоптоза

Апоптоз имеет свои отличительные морфологические признаки, как на светооптическом, так и на ультраструктурном уровне. Наиболее четко морфологические признаки выявляются при электронной микроскопии. Для клетки, подвергающейся апоптозу характерно:

Сжатие клетки. Клетка уменьшается в размерах; цитоплазма уплотняется; органеллы, которые выглядят относительно нормальными, располагаются более компактно. Предполагается, что нарушение формы и объема клетки происходит в результате активации в апоптотических клетках трансглютаминазы и цистеиновых протеаз (каспаз). Первая группа ферментов вызывает образование перекрестных связей в цитоплазматических белках, что приводит к формированию своеобразной оболочки под клеточной мембраной, подобно ороговевающим клеткам эпителия, а вторая группа ферментов разрушает белки в цитозоле.

Конденсация хроматина. Это наиболее характерное проявление апоптоза. ДНК расщепляется эндонуклеазами в местах, связывающих отдельные нуклеосомы, что приводит к образованию большого количества фрагментов, в которых число пар оснований делится на 180-200, которые затем конденсируются под ядерной мембраной. Ядро может разрываться на два или несколько фрагментов.

Формирование апоптотических телец. В апоптотической клетке формируются глубокие впячивания клеточной мембраны, что приводит к отшнуровке фрагментов клетки, т.е. формированию окруженных мембраной апоптотических телец, состоящих из цитоплазмы и плотно расположенных органелл, с или без фрагментов ядра.

Фагоцитоз апоптотических клеток или телец осуществляется окружающими здоровыми клетками, как макрофагами, так и паренхиматозными. Апоптотические тельца быстро разрушаются в лизосомах, а окружающие клетки либо мигрируют, либо делятся, чтобы заполнить освободившееся после гибели клетки пространство.

При окраске гематоксилином и эозином апоптоз определяется в единичных клетках или небольших группах клеток. Апоптотические клетки имеют округлую или овальную форму, интенсивно эозинофильную цитоплазму с плотными фрагментами ядерного хроматина. Поскольку сжатие клетки и формирование апоптотических телец происходит быстро и также быстро они фагоцитируются, распадаются или выбрасываются в просвет органа, то на гистологических препаратах апоптоз обнаруживается в случаях его значительной выраженности. К тому же апоптоз – в отличие от некроза – никогда не сопровождается воспалительной реакцией, что также затрудняет его гистологическое выявление.

Для выявления клеток, находящихся на ранних этапах апоптоза, используют специальные иммуногистохимические исследования, например, определение активированных каспаз или TUNEL-метод, визуализирующий разорванную эндонуклеазами ДНК.

Значение апоптоза.

1. Апоптоз имеет огромное значение в эмбриогенезе (включая имплантацию и органогенез). Нарушение гибели клеток в межпальцевых промежутках может привести в синдактилии, а отсутствие апоптоза избыточного эпителия при слиянии небных отростков или тканей, окружающих нервную трубку, приводит к нарушению слияния тканей с двух сторон, что проявляется расщеплением твердого неба и дефектом в тканях, ограничивающих спинномозговой канал, (spina bifida), соответственно.

2. Апоптоз играет важную роль в поддержании постоянства клеточного состава, особенно в гормон-чувствительных тканях. Замедление апоптоза приводит к гиперплазии тканей, ускорение – к атрофии. Он принимает участие в отторжении эндометрия во время менструального цикла, атрезии фолликулов в яичниках в менопаузе и регрессии ткани молочной железы после прекращения лактации.

3. В данный момент исследуется огромное количество лекарственных препаратов, направленных на регуляцию апоптоза в определенных тканях. Так, ускорение апоптоза иммунокомпетентных клеток можно использовать для лечения аутоиммунных заболеваний и предотвращения отторжения трансплантата, замедление апоптоза может использоваться для предотвращения апоптоза в тканях, испытывающих ишемию, повышенное внешнее давление или временно бездействующих тканях. Замедление апоптоза при вирусных инфекциях предотвращает распространение инфекции на соседние клетки.

4. Во всех опухолях наблюдается нарушение апоптоза в опухолевых клетках. Эта поломка может происходить на разных этапах апоптоза, например, может происходить мутация гена р53, что приведен к тому, что мутантный протеин-р53 будет накапливаться в клетке в избыточном количестве, но не будет вызывать апоптоз несмотря на дефекты в геноме клетки, что приведет к пролиферации клеток с нарушенным геномом, причем с каждым последующим делением нарушения в ДНК будут накапливаться. Иногда в опухолевых клетках может накапливаться и нормальный, или «дикий», протеин р53, если поломка в механизме апоптоза происходит на других уровнях. При хронических лимфоидных лейкемиях наблюдается накопление продуктов гена bcl-2, что приводит к патологическому удлинению срока жизни опухолевых клеток и резистентности клеток к различным проапоптотическим факторам. Иногда нарушается передача сигналов от рецепторов гибели клеток, например, с рецептора к TNF-α. TNF-α принимает участие в регуляции клеточной популяции по типу обратной связи. Все клетки в популяции выделяют TNF-α в небольших количествах; чем больше клеток в ткани, тем выше концентрация TNF-α, а значит и уровень апоптоза. Таким образом достигается баланс между пролиферацией и гибелью клеток. Опухолевые клетки теряют способность подвергаться апоптозу под действием этого цитокина, при этом он накапливается в большом количестве в опухолевой ткани. В результате этого TNF-α начинает в большом количестве попадать в кровоток и вызывать апоптоз паренхиматозных клеток во многих органах, приводя к кахексии.

Явления запрограммированной клеточной гибели известны уже более 100 лет, но оставались «в тени» некробиотических процессов, которые на протяжении десятилетий изучались намного более активно, чем программируемая гибель. Этот вид клеточной гибели представляет собой важнейший интегральный компонент эмбриогенеза, морфогенеза и роста тканей, а также гормонозависимой инволюции. Он, наряду с лизосомальнойаутофагией , участвует в механизмах таких клеточных адаптации, какатрофия (уменьшение размеров клеток и числа функционирующих структур в них при сохранении жизнеспособности клетки) игипоплазия (уменьшение органа вследствие уменьшения числа клеток в нем при сохранении его жизнеспособности).

Так, например, показано, что инволютивные изменения в коре надпочечников после гипофизэктомии тормозятся актиномицином Д, а, значит, представляют собой активный процесс реализации некой программы саморазборки клеток.

Для обозначения процесса запрограммированной клеточной гибели, морфологически и патохимически отличного от некробиоза, предложен термин «апоптоз». Основатели учения об апоптозе, в частности, Дж. Керр и соавт, считали понятия «запрограммированная клеточная гибель» и «апоптоз» равнозначными. В последнее время имеется тенденция применять первый термин к процессам устранения клеток в раннем онтогенезе, а понятие апоптоз относить только к программируемой гибели зрелых дифференцированных клеток. Так, указывают на наличие аутофагии и отсутствие разрывов ДНК при эмбриональной клеточной гибели, в отличие от апоптоза зрелых клеток.

Вопрос о соотношении некробиоза и апоптоза и о приуроченности этих механизмов к естественной либо насильственной гибели клеток нуждается в обсуждении. Было бы упрощением сказать, что апоптоз – это исключительно процесс естественной гибели клеток, а некробиоз – насильственной. Деление на эти два процесса далеко не абсолютно. Выше, обсуждая паттерны некробиоза, мы уже много раз вынуждены были упоминать об апоптозе, так как между этими процессами много общего. Дело в том, что в ответ на минимальное повреждение или повреждение, не вызывающее быстрого развития глубокой гипоксии и выраженного энергодефицита, клетки могут включать специальную программу самоуничтожения и реагировать апоптозом. В этом случае, например, при действии ионизирующего излучения или вируса СПИДа, смерть клетки насильственна, но механизм ее не некробиотический, а апоптотический. Тельца Каунсильмена, обнаруживаемые при вирусном гепатите в печени, представляют собой результат апоптоза гепатоцитов под воздействием вирус-индуцированного повреждения. Это также насильственная гибель, но механизм ее не связан с быстропрогрессирующей гипоксией и позволяет клетке успеть включить программу саморазборки. Не подлежит сомнению насильственный характер гибели клеток-мишеней под воздействием фактора некроза опухолей. Однако, несмотря на свое категоричное название, данный биорегулятор вызывает в таргетных клетках не только некроз, но и апоптоз. При реализации некробиоза и апоптоза функционируют многие общие механизмы, например, увеличение цитоплазматической концентрации ионизированного кальция и образование свободных активных кислородных радикалов. Более того, при большей силе и интенсивности действия апоптогенный стимул может вызвать некробиоз, очевидно, вследствие того, что прогрессирующий энергодефицит не дает возможности клеткам реализовать энергетически «дорогую» динамику апоптоза.

Таблица 1

Типовые характеристики основных способов гибели клетки.

Если некробиоз всегда сопровождается освобождением в окружающую ткань, а при массивном поражении – и в системный кровоток, медиаторов воспаления, в частности, липидных продуктов деструкции клеточных мембран, то апоптоз протекает без лейкоцитарной демаркации и перифокального воспаления, так как его механизм позволяет избежать значительного выделения медиаторов клеточного повреждения. Издание в 1996 году всеобъемлющей монографии, посвященной апоптозу, облегчает нашу задачу и делает возможным охарактеризовать в данной книге лишь наиболее общие и патофизиологически важные аспекты этой проблемы.

1. Устранение клеток в раннем онтогенезе.

2. Физиологическая инволюция и уравновешивание митозов в зрелых тканях и клеточных популяциях

3. Реализация процессов атрофии и регрессия гиперплазии

4. Альтруистический суицид мутантных и пораженных вирусами клеток

5. Клеточная гибель после слабого воздействия агентов, вызывающих при массированном поражении некроз.

Чтобы более наглядно представить отличия некробиоза и апоптоза, авторы предлагают подробно изучить приводимую таблицу.

Важно отметить, что некроз происходит после насильственной гибели клетки в результате каких-либо причин, вызывающих глубокую тканевую гипоксию, и всегда содержит литический компонент в виде либо лизосомального аутолиза, либо гетеролиза, вызываемого гидролазами фагоцитов. По современным представлениям, аутолиз при гибели клетки носит посмертный характер, а не является элементом некробиоза. Тем не менее, раннее и значительное повреждение клеточных мембран – неотъемлемая часть процессов некробиоза, и практически не наблюдается при апоптозе.

Апоптоз – генетически управляемый процесс, который может быть включен различными пусковыми сигналами без какого-либо существенного предварительного повреждения исполнительного аппарата клетки, хотя может и включиться после умеренного повреждения как альтруистическое самоубийство. Устранение клеток без повреждения возможно и при экспрессии антигена стареющих клеток. Возможно, что эти ме­ханизмы «ухода без скандала» комбинируются и/или взаимодействуют.

Принципиально важно, что при неспособности вступить в апоптоз возникает неограниченно пролиферирующий клон клеток, что ведет к серьезным нарушениям в многоклеточном организме и наблюдается, например, при онкологических заболеваниях. До сих пор в данной книге мы часто упоминали об отно­сительной полезности и потенциальной патогенности различных запрограммированных защитных процессов и приводили примеры такой «вредной полезности». В данном случае мы видим основное противоречие патофизиологии, как бы, в обратном ракурсе. Иными словами, апоптоз в клеточном цикле выступает как минимальное запрограммированное зло и также иллюстрирует основное положение наших рассуждений, так как является приспособительной смертью, гибелью по программе и своего рода «полезным вредом» в чистом виде. В любом случае, наблюдения за злокачественными клетками, утратившими под действием онкогенов способность к апоптозу, доказывают, что для клеток утрата способности вовремя умереть – большое зло.

Апоптоз может начаться как ответ генов, программирующих клеточную саморазборку, на рецепторно-опосредоваиный сигнал (например, при стимуляции соответствующими биорегуляторами рецепторов ФНОили глюкокортикоидного рецептора лимфоцитов).

Не только ФНО и глюкокортикоиды, но и почти все цитокины, включая 13 интерлейкинов и 3 интерферона могут быть кодовыми сигналами апоптоза, причем в одних клетках они его запускают, а в других – ингибируют. Тканеспецифические факторы роста и гемопоэтины являются ингибиторами апоптоза для своих клеток-мишеней. Тропные гормоны гипофиза оказывают свой трофический эффект на железы-мишени также путем ингибирования апоптоза.

Сигнал может оказывать на клетку разнонаправленное в отношении апоптоза действие в зависимости от исходного состояния мишени, как это описано выше для ФНО.

В роли генетических индукторов апоптоза, срабатывающих в ответ на рецепторный сигнал, могут выступать гены FAS/АРО-1, с-мус, мах, р53,ced-З и другие. Подавление экспрессии некоторых генов, например,bcl-2, также вызывает апоптоз. Детальное изучение механизмов, с помощью которых продукты этих генов запускают или сдерживают апоптоз, только начато. Однако уже выяснено, что они могут усиливать образование активных кислородных радикалов (как белок АРО-1, гомологичный рецептору фактора некроза опухолей), регулировать перенос кальция в цитоплазму (как продукт генаbcl-2), запускать нейтральные протеазы цитозоля (как продукт генаced-3), связываться с ДНК (как димер белков мус-мах).

Принципиально важно, что апоптоз может быть индуцирован даже в безъядерных постклеточных структурах. Следовательно, первичным звеном апоптоза могут быть не только ядерные события, но и определенные метаболические изменения в цитоплазме или активация долгоживущих матричных РНК, как в случае с антигеном стареющих клеток.

Инициировать апоптоз могут активные кислородные радикалы (АКР). При умеренных повреждениях клетки в отсутствие гипоксии происходит редукция трансмембранного потенциала митохондрий и генерация ими АКР. Если антиоксидантные системы клетки не компенсируют сдвига редокс-потенциала, процесс прогрессирует. При условии отсутствия выраженного энергодефицита и сохранности генетического аппарата реализуется апоптоз, но глубокая гипоксия и выраженные повреждения ДНК инициируют некробиоз. При развитии апоптоза АКР изменяют условия взаимодействия кальция с кальмодулином и способствуют нарастанию цитоплазматической и внутриядерной активности (а при блокаде гена bcl-2 – и росту внутриклеточной концентрации) кальция.

Кальций-зависимое звено механизма апоптоза активирует кальпаины, что ведет к протеолизу белков цитоскелета, образованию цитоплазматических выпячиваний, разрушению межнуклеосомных связей в ядре. Активируется кальцийзависимая эндонуклеаза. Это провоцирует упорядоченные межнуклеосомные разрывы хроматина и фрагментацию ядра. Кальций-зависимая трансглютаминаза агрегирует цитозольные белки. Конечным этапом процесса служит распад клетки на апоптотические тельца и их аутофагоцитоз.

Существуют два хорошо охарактеризованных пути апоптоза: с участием рецепторов клеточной гибели (внешний путь) и с участием митохондрий (собственный путь)

Активация каспаз и апоптоз индуцируются связыванием специфических лигандов из группы TNF со своими рецепторами (рецепторы клеточной гибели)

У позвоночных активация каспаз происходит при различных путях . На рисунке ниже представлены два хорошо известных пути. Это путь с участием рецепторов клеточной гибели (который также называется внешний путь) и путь с участием митохондрий (собственный путь). Хотя между обоими путями имеется несколько существенных различий, они обладают чертой сходства, котороая заключается в том, что каждый включает этап активации инициирующей каспазы по механизму индуцированного сближения с последующей активацией эффекторных каспаз.

Вместе с тем, наблюдается некоторый перекрест между двумя механизмами , поскольку путь с участием рецепторов клеточной гибели может включать элементы митохондриального пути.

Представляют собой подгруппу относящихся к семейству рецепторов фактора некроза опухоли (TNFR) позвоночных. Они включают TNFR1, Fas (также называемый CD95 или АРО-1) и TRAIL (TRAIL-R1, -R2 у человека, также называемые DR4 и DR5). На рисунке ниже представлены различные типы рецепторов клеточной гибели.

Эти тримерные рецепторы связываются со специфическими лигандами (TNF, Fas-лигандом или TRAIL соответственно) и могут быстро запускать в клетках процесс апоптоза. Лиганды продуцируются различными клетками, включая клетки иммунной системы, часто в ответ на факторы, вызывающие воспаление.

Рецепторы гибели клеток содержат домен смерти, расположенный внутри клетки. Эти домены, как и домены CARD, DED и PYR, представляют собой еще один пример складок смерти, и они взаимодействуют с доменами смерти в адаптерных молекулах.

Находятся на поверхности клеток в виде тримеров, и, вероятно, соответствующие лиганды располагаются в виде кластеров, которые связаны с двумя и более этих тримеров. Такое расположение делает рецепторы доступными для взаимодействия с внутриклеточными белками. После связывания между собой доменов гибели Fas/CD95 и рецепторов TRAIL, они ассоциируют с адаптерным белком FADD (Fas-associated death domain). Эта ассоциация возникает при участии домена гибели FADD белка.

При этом в клетке молекулы FADD сближаются, и становится доступным другой регион белка, содержащий DED.

Домен DED белка FADD теперь связывается с DED-участками продомена мономера каспазы-8, что приводит к образованию димеров и активации инициаторной каспазы по механизму индуцированного сближения. После связывания рецептора гибели быстро образуется комплекс, содержащий FADD (за счет взаимодействия с доменом гибели). FADD связан с каспазой-8 (за счет взаимодействия с DED). Это сигнальный комплекс, индуцирующий клеточную гибель (англ, death-inducing signaling complex, DISC).

Активированная каспаза-8 начинает расщеплять в клетке субстраты, включая эффекторные каспазы-3 и -7, и происходит апоптоз. На рисунке ниже представлена последовательность событий при развитии апоптоза с участием рецепторов клеточной гибели.

Известно много примеров апоптоза , происходящего с участием рецепторов клеточной гибели. Этот путь особенно характерен для функционирования эффекторов иммунной системы и для регуляции иммунных процессов. Внешний путь апоптоза также реализуется в клетках другого происхождения, включая нейроны. В настоящее время в качестве возможного противоопухолевого средства исследуется TRAIL, который обладает способностью индуцировать апоптоз в клетках некоторых опухолей.

В соответствии с установленной ролью Fas в иммунной системе у людей, а также у мышей, несущих мутации, затрагивающие Fas или его лиганд, наблюдается заболевание, при котором происходит массивное разрастание лимфатических органов. Это разрастание обусловлено накоплением измененной популяции Т-клеток. У больных также отмечаются аномалии В-лимфоцитов, включающие продуцирование аутоиммунных антител и развитие В-клеточных лимфом.

При реализации апоптоза условно можно выделить четыре стадии.

Инициация -> Программирование -> Реализация программы -> Удаление погибшей клетки

Стадии апоптоза Стадия инициации

На этой стадии информационные сигналы рецептируются клеткой . Патогенный агент либо сам является сигналом, либо обусловливает генерацию сигнала в клетке и его проведение к внутриклеточным регулятор-ным структурам и молекулам.

Инициирующие апоптоз стимулы могут быть трансмембранными или внутриклеточными.

Трансмембранные сигналы подразделяют на отрицательные, положительные и смешанные.

- Отрицательные сигналы : отсутствие или прекращение воздействия на клетку факторов роста, цитокинов, регулирующих деление и созревание клетки, а также гормонов, контролирующих развитие клеток. В норме действие названных выше групп БАВ на мембранные рецепторы обеспечивает подавление программы гибели клеток и нормальную их жизнедеятельность. Напротив, их отсутствие или снижение эффектов «освобождает» программу апоптоза. Так, для нормальной жизнедеятельности ряда нейронов необходимо постоянное наличие нейротрофических факторов. Их устранение или снижение эффектов на нервные клетки может привести к включению программы смерти нейрона. - Положительные сигналы в итоге генерируют запуск программы апоптоза . Так, связывание ФИО (FasL) с его мембранным рецептором CD95 (Fas) активирует программу смерти клетки. - Смешанные сигналы являются комбинацией воздействий сигналов первой и второй групп. Так, апоптозу подвергаются лимфоциты, простимулированные митогеном, но не проконтактировавшие с чужеродным Аг. Погибают и те лимфоциты, на которые воздействовал Аг, но не получившие других сигналов, например митогенного или от HLA.

Среди внутриклеточных стимулов апоптоза зарегистрированы избыток Н+, свободные радикалы липидов и других веществ, повышенная температура, внутриклеточные вирусы и гормоны, реализующие свой эффект через ядерные рецепторы (например, глюкокортикоиды).

Апоптоз: стадия инициации.

Стадия программирования

Стадия программирования (контроля и интеграции процессов апоптоза) представлена на рисунке.

На этой стадии специализированные белки либо реализуют сигнал к апоптозу путём активации исполнительной программы (её эффекторами являются цистеиновые протеазы - каспазы и эндонуклеазы), либо блокируют потенциально летальный сигнал.

Выделяют два (не исключающих друг друга) варианта реализации стадий программирования : 1) путём прямой активации эффекторных каспаз и эндонуклеаз (минуя геном клетки) и 2) опосредованной через геном передачи сигнала на эффекторные каспазы и эндонуклеазы.

Прямая передача сигнала осуществляется через адапторные белки, гранзимы и цитохром С.

Адапторные белки . В качестве адапторного белка выступает, например, каспаза-8. Так реализуют своё действие цитокины Т-лимфоцитов-киллеров в отношении чужеродных клеток, ФНО и другие лиганды CD95.

Цитохром С . Выделяясь из митохондрий, цитохром С вместе с белком Apaf-1 и каспазой-9 формирует комплекс активации (апоптосому) эффекторных каспаз. Каспаза-8 и каспаза-9 активируют эффекторные каспазы (например, каспазу-3), которые участвуют в протеолизе белков.

Гранзимы . Эти протеазы выделяют цитотоксические Т-лимфоциты, протеазы проникают в клетки-мишени через цитоплазматические поры, предварительно сформированные перфоринами. Гранзимы активируют аспартатспецифи-ческие цистеиновые протеазы клетки-мишени, подвергающейся апоптозу.

Прямая передача сигнала наблюдается обычно в безъядерных клетках, например в эритроцитах.

Апоптоз: стадия программирования.

Опосредованная передача сигнала подразумевает репрессию генов, кодирующих ингибиторы апоптоза, и активацию генов, кодирующих промоторы апоптоза.

Белки-ингибиторы апоптоза (например, продукты экспрессии антиапоптозных генов Bcl-2, Bcl-XL) блокируют апоптоз (например, путём уменьшения проницаемости мембран митохондрий, тем самым уменьшая вероятность выхода в цитозоль одного из пусковых факторов апоптоза - цитохрома С).

Белки-промоторы апоптоза (например, белки, синтез которых контролируется генами Bad, Box, антионкогенами Rb или /т53) активируют эффекторные кас-пазы и эндонуклеазы.

13195 0

Апоптозом (от греч. apoptosis — опадание) названо явление программируемой гибели клетки, сопровождаемой набором характерных цитологических признаков (маркёров апоптоза) и молекулярных процессов. Термин введён А. Керром с соавторами (Kerretal, 1972). Принципиальным отличием апоптоза от некроза является то, что первый сопровождается характерным каскадом реакций процесса элиминации клетки, а некроз есть результат незапланированного события и происходит спонтанно (Harmonetal., 1998) (рис. 1).

Рис. 1. Схема ультраструктурных изменений клетки при апоптозе и некрозе, предложенная лабораторией специальной микроскопии Донецкого ГМУ

Характерный каскад процессов при апоптозе включает: (а) конденсацию хроматина, (б) разрушение ядра, (в) вспучивание плазматической мембраны, (г) фрагментацию клетки с образованием дискретных апоптозных тел (АпТ). Апоптоз может быть вызван как внешними воздействиями (например, ядами), так и внутриклеточными сигналами, включая активацию «генов смерти». При этом механизмы апоптоза могут быть не только запрограммированными, но и спонтанными (Фильченков, Стойка, 1999).

Апоптоз в эволюции появился, по-видимому, вместе с появлением эукариотных многоклеточных организмов для регуляции численности клеток и установления между клетками в организме определенных взаимоотношений. Клетки взаимодействуют на разных стадиях жизненного цикла, например, при делении, росте, дифференцировке и гибели. Исследование молекулярных механизмов гибели (запрограммированной?) клетки стало в последние годы одной из самых трудных и актуальных проблем биологии.

Проблема апоптоза в настоящее время вызывает повышенный интерес со стороны специалистов разных научных дисциплин. Активацией апоптоза объясняют протекание СПИД, заболеваний локомоторного аппарата, нервной системы, болезней Вильсона, Паркинсона, Альцхаймера и Гетчинсона (прогерия , преждевременное старение). Вероятно, по механизму апоптоза отмирают клетки при ишемии мозга и инсульте, а также при анемиях (Белушкина, Белецкий, 2004).

В здоровом организме в норме в разных процессах также происходит удаление клеток путем апоптоза. Например, при росте и развитии организма. В процессе развития ЦНС нейронов образуется больше, чем необходимо, лишние удаляются. Апоптоз необходим также для реализации иммунного ответа. Один из механизмов защиты предполагает существенное увеличение количества лимфоцитов, которые при внедрении чужеродных микроорганизмов продуцируют антитела. После уничтожения этих микроорганизмов большинство таких специфических клеток соединительной ткани уничтожаются; таким образом, механизм удаления ненужных клеток необходим для выживания организма.

Этот механизм действует также при атрофии клеток под действием цитокинов (фактор некроза опухоли), при вирусных заболеваниях (например, при синдроме приобретенного иммунодефицита — СПИД), при нейрогенеративных заболеваниях. Недостаток апоптоза приводит к раку и другим опухолям; его избыток приводит к потере клеток. В молодом возрасте апоптоз является полезным, в дальнейшем он участвует в процессах старения.

Определены некоторые признаки апоптоза, отличающие его от некроза:

• фосфатидилсерин из внутреннего слоя цитоплазматической мембраны перемещается в наружный;
• цитохром с из межмембранного пространства митохондрий выходит в цитоплазму; активируются цистеиновые протеиназы (каспазы );
• увеличивается образование активных форм кислорода (АФК); цитоплазматическая мембрана сморщивается, а объем клетки уменьшается;
• нити ядерной ДНК в межнуклеосомных участках разрываются, хроматин конденсируется по периферии ядра, которое затем распадается на части;
• клетки фрагментируются на везикулы с внутриклеточным содержимым (апоптотические тельца ). В отличие от некроза, в случае апоптоза целостность цитоплазматической мембраны сохраняется до поздних стадий процесса, несмотря на сморщивание.

Выявлены некоторые молекулярные процессы, наблюдаемые при апоптозе:

1) действие Са 2 + и Zn 2 + (главных неорганических мессенджера и гормона , соответственно), имеющее взаимно антагонистический характер,

2) изменение мембранных белков в апоптотических клетках,

3) активирование разных путей передачи сигнала для апоптоза.

При апоптозе изменяются мембраны, в частности, гликопротеины и гликолипиды теряют сиаловую кислоту , а на клеточной поверхности увеличивается количество рецептора витронектина и, как указывалось выше, фосфатидилсерина — факторов, привлекающих макрофаги.

При апоптозе активируются разные изоформы фосфолипазы с, затем образуются вторичные мессенджеры диацилглицерин (DAG) и инозит-1,4,5-трифосфат (IP3). DAG активирует семейство сериновых и треониновых киназ (протеинкиназа с), a IP3 стимулирует освобождение Са 2 + из внутриклеточных депо в цитозоль. Вызывать апоптоз могут также тирозинкиназы и некоторые токсины , нарушающие гомеостаз Са .

Предложена гипотеза о существовании генетической программы самоуничтожения митохондрий, клетки, органа, организма, соответственно — митоптоз, апоптоз, органоптоз, феноптоз . Эта программа названа «самурайским законом биологии» (В.П. Скулачев, 1996). При апоптозе в клетке образуется специфический «белок самоубийства» р53 , который способствует реализации этой программы. Активация этого белка некоторыми интерферонами даёт эффект при лечении рака . В настоящее время проблему апоптоза исследуют весьма активно, так как она связана с решением проблемы старения. Если бы удалось регулировать апоптоз, можно было бы замедлить старение человека.

Исходя из гипотезы, что запуск программы самоуничтожения начинается вследствие снижения активности антиокислительной системы (АО С) в митохондриях и накопления в них активных форм кислорода (АФК), был предложен путь борьбы с этим явлением путем внедрения в органеллы клеток веществ с антиокислительными свойствами.

Однако действие известных естественных антиокислителей, в частности, витаминов С и Е, к успеху не приводило. Поэтому синтезировали вещества со свойствами АОС. После многочисленных испытаний оказалось, что оптимальным для этой цели являются фенилфосфониевые катионы (ФФК). Из них было синтезировано вещество, названное «ионом Скулачева» (SkQ). Он представляет собой комплексное соединение тетрафенилфосфониевого катиона , где ионом-комплексообразователем является Р(III) (рис. 2). Такая структура имеет делокализованный положительный заряд.

Рис. 2. Ион Скулачева — трифенилфосфин, связанный деканом с пластохиноном.

Видно, что SkQ алкилирован деканом C 10 H 22 образованием поляризованной молекулы с положительно заряженной головкой иона и липофильным хвостом. Этот комплекс легко проникает в клетку через отрицательно заряженную плазматическую мембрану в цитоплазму и через еще более отрицательно заряженную митохондриальную мембрану в матрикс органеллы и накапливается там, предположительно, в результате простого взаимного притяжения разноименных зарядов по физическим законам. Пластохинон, по мнению авторов, увеличивает антиоксидантную активность иона.

Точечное воздействие даже при наноконцентрациях позволяет этому комплексу длительно находиться внутри митохондрий (до 4-суток). Ферменты, находясь в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР), не могут разрушить этот комплекс внутри митохондрий, поскольку неспособны преодолеть мембранный барьер.

Скулачев полагает, что антиокислительные свойства иона SkQ, позволяют нейтрализовать свободные радикалы внутри митохондрий и тем самым оказывают положительное фармакологическое действие, активируя АО С. Однако такое объяснение совсем не учитывает твердо установленное влияние на процессы апоптоза ионов металлов, в частности, Са 2 + и Zn 2 + , и законы межэлементных взаимодействий, в частности, их антагонизм.

С точки зрения бионеорганики механизм процессов апоптоза и влияния на них фенилфосфониевых катионов более сложен. В соответствие со следствием закона замещения , «свободный» Са вытесняет ионы переходных металлов из комплексов с белками и нуклеопротеинами, нарушая их функционирование и вызывая полимикроэлементоз . Избыток Са 2 + вытесняет Mg 2 + , инактивируя все обменные процессы, связанные с АТФ. В первую очередь это проявляется в снижении активности натриевого насоса и, следовательно, мембранного потенциала (Ψ) и зависящих от него процессов нейтрализации свободных радикалов. Из-за вытеснения из ферментов АОС ионов металлов-комплексообразователей (Fe, Си, Se, Zn ) активность этих ферментов по определению снижается.

Поскольку основные ферменты АОС (каталаза, пероксидаза, цитохромоксидаза, глутатионпероксидаза) содержат гемин с Fe, Си , а селенопротеины — Se и I , избыток Са 2 + в цитоплазме автоматически приводит к резкому снижению антиокислительной активности без участия каких-либо генов. При преодолении фракционного порога начинается цепная реакция , то есть в каждом атоме с неспаренным электроном появляется свободный радикал. Запускается цепь превращений уже существующих валентнонасыщенных исходных молекул в более реакционноспособные продукты. Причем процессы апоптоза начинаются с нарушения деятельности мембран, вероятно, каким-то образом связанного с синтезом коллагена.

«Свободный» Са 2 + играет на начальных стадиях развития апоптоза ключевую роль, поскольку является инициатором цепной реакции. Его концентрация при апоптозе в клетках всегда увеличивается. «Свободный» Са цитотоксичен, он нарушает многие процессы метаболизма. В частности, в результате активируются эндонуклеаза , расщепляющая ДНК во внутренних участках нуклеосом, и тканевая трансглутаминаза , ковалентно связывающая белки с мембраной изопептидными связями. Понятно, что при этом нарушается функционирование и нуклеопротеинов, и мембран.

Zn 2 + , в соответствии с законом замещения , будучи ионом непереходного металла 4 периода, образующим комплексы с биолигандами с наибольшими К уст, способен снижать концентрацию Са в клетках и, следовательно, отдалять начало апоптоза. Поэтому его считают ингибитором этого процесса, подавляющим, в частности, активность эндонуклеазы и трансглутаминазы. Отмеченное всеми исследователями апоптоза замедление процесса гибели клеток при поступлении в них Zn 2 + объясняется тем, что содержание «свободного» Са 2 + в цитоплазме клеток уменьшается, а активность АОС возрастает. Поэтому можно полагать, что любое воздействие, снижающее фракцию «свободного» Са 2 + в клетке и её органеллах, будет замедлять процессы старения и оказывать положительный фармакологический эффект при заболеваниях, сопровождаемых накоплением этой фракции. Среди таких заболеваний можно назвать болезни глаз, остеопороз, прогерию и болезнь Дауна .

Механизм цепной реакции , как и его особенности, хорошо известны на примере атомной бомбы. Характерным свойством этой реакции является её многостадийностъ . Среди важнейших стадий — зарождение цепи (инициирование ), продолжение цепи (зарождение новых активных частиц = радикалов), обрыв цепи («гибель » активных частиц). Сами цепи могут быть неразветвленными , когда на каждую израсходованную активную частицу приходится одна вновь образованная, или разветвленными , когда на одну израсходованную активную частицу приходится две и более вновь образованных.

Разветвленные цепные реакции могут происходить в стационарном режиме, когда скорость разветвления меньше скорости гибели активных частиц, и в нестационарном , когда гибель происходит медленнее, чем разветвление. В этом случае скорость реакции возрастает по экспоненте и лимитируется только расходованием исходных веществ. Причем переход от стационарного к нестационарному режиму происходит скачкообразно при очень небольшом изменении концентрации одного из исходных веществ — наблюдается цепной «взрыв».

Цепные реакции отличаются очень эффективным изменением их свойств, и даже направленности, при наличии ничтожных примесей веществ, способных выводить из системы активные частицы, то есть ингибиторов , или, напротив, облегчать их формирование — инициаторов . Именно по такому механизму, многостадийно и очень медленно на первых стадиях, развивается процесс апоптоза. Следовательно, при рассмотрении этой проблемы надо исходить из общих закономерностей, а не частных, связанных с «генами смерти» или «борьбой» со свободными радикалами. Именно по этой причине антиокислительные витамины Е и С не оказывают существенного воздействия на процессы апоптоза, так как воздействуют не на причину цепной реакции, а на её следствие.

Р (III) в SkQ, являясь комплексообразователем, не способен многократно изменять свою валентность — что совершенно необходимо для процесса переноса электронов, происходящего в АОС. В то же время известно, что P (V), образуемый при окислении Р (III), является компонентом кислородных кислот, в частности фосфорной кислоты, которая легко связывается с Са 2 + , образуя трифосфат Ca 3 (P 3 O 10) 2 . Анион с пятивалентным фосфором в этом соединении является секвестрирующим агентом , а образовавшаяся соль устойчива, что выводит Са 2 + из «свободной» фракции.

С точки зрения бионеорганики фенилфосфониевые катионы, в случае их попадания внутрь клеток и митохондрий, служат эффективным источником активного фосфора для нейтрализации избытка «свободного» Са 2 + . То есть они, как и Zn 2 + , оказываются ингибитором цепной реакции апоптоза, но с иным механизмом действия.

Описанным механизмом апоптоза объясняется, в частности, факт продления жизни атлантического лосося при заражении жабр личинками двустворчатого моллюска жемчужницы Margarititera margarititera . Эти личинки усиленно поглощают «свободный» Са 2 + для построения своей раковины, то есть в данном случае оказываются секвестрирующим агентом в цепной реакции начавшегося полимикроэлементоза, блокируя эту реакцию.

Альбатрос живет около 50 лет, и в течение его жизни признаков старения, в том числе репродуктивной функции, не появляется, после чего птица неожиданно умирает от спонтанного «взрывного» ускорения процессов апоптоза. Это объясняется тем, что согласно правилу фракционного порога , в некоторый момент возрастающая концентрация «свободного» Са 2+ преодолевает такой порог, наступает нестационарная стадия цепной реакции, приводящая к быстрому финалу — смерти организма.

Опыты на животных (лабораторных грызунах, кроликах, собаках, кошках, лошадях) с дистрофией сетчатки и катарактой, которым закапывали в глаза 20 нМ раствор SkQ, показали, что после нескольких недель лечения болезни глаз излечивались, причем прозревали даже некоторые слепые животные. Получены положительные предварительные данные об использовании SkQ для лечения 12 различных старческих заболеваний, в частности, остеопороза, инфарктов и болезней глаз — глаукомы и катаракты . Предполагаемый механизм развития апоптоза показан на рис. 3.

Рис. 3. Предполагаемый механизм развития апоптоза

Проблема рака противоположна проблеме апоптоза. В отличие от старения, когда нужно замедлить процесс апоптоза, при раке нужно сделать прямо противоположное - ускорить этот процесс в раковых клетках. Наиболее эффективны для этого могут быть меры, увеличивающие содержание «свободной» фракции Са в цитозоле клеток и в митохондриях выше фракционного порога, после которого начинается цепная реакция апоптоза в виде гибели раковых клеток. Исходя из особенностей механизмов цепной реакции, подобный эффект должен проявляться уже при наноконцентрациях действующих веществ.

Что касается теории об апоптозе, как генетически запрограммированной смерти, не менее вероятной представляется гипотеза о цепной реакции нарушения металл-лигандного гомеостаза. Цепные реакции отражают более фундаментальные природные процессы, чем сопутствующие им генетически закреплённые биологические проявления. Поэтому гипотезу о природе апоптоза, как проявлении цепной реакции микроэлементоза кальция, переходящего в полимикроэлементоз, нельзя отбросить без объяснения роли металлов в этом процессе с точки зрения общераспространённой теории.

Известно, что запись кода не всегда соответствует «центральной догме» биологии (ДНК > РНК > белок). Открытие отмеченных Нобелевскими премиями обратных ревертаз, в том числе теломераз (2009 г.), а также прионов (Prusiner, 1997), подтверждает правомерность такой точки зрения. Активация «спящих генов» вызывается тем или иным состоянием металл-лигандного гомеостаза. Например, соотношение металлов, связанных с нарушением обмена Си , «будит» или ген синтеза белков болезни Вильсона, которая в настоящее время излечима, или ген синтеза белков болезни Менкеса, которая пока неизлечима. При этом «разбуженный» ген полностью подавляет другой (Bertini, 2008).

Медицинская бионеорганика. Г.К. Барашков